癌症的演变是一个复杂的高度动态过程，并且持续时间较长。分析癌症的演变过程可以确定其未来的发展轨迹，对癌症预防和治疗具有深远的临床意义。但直接分析这一过程仍具有挑战性，因为需要纵向癌症患者样本来记录进化史。因此，癌症演变通常是从单个时间点数据推断出来的。

DNA甲基化被作为生物标志物来记录细胞群体的克隆结构或增殖历史。一种波动CpG位点的DNA甲基化随时间随机波动，起着“甲基化条形码”的作用，为在患者样本中进行高时间分辨率的谱系追踪提供了一种低成本的选择。

近日，英国联合西班牙研究团队开发了一种名为EVOFLUx（evolutionary inference using fluctuating methylation ）的新方法，该方法基于随时间变化的天然DNA甲基化条形码，仅需输入临床样本的肿瘤甲基化谱即可精确定量推断演变动态。研究团队将EVOFLUx应用于1,976例特征明确的淋巴样癌症样本（涵盖多种疾病类型）分析，发现不同疾病类型的初始肿瘤生长速率、恶性程度和表观突变率存在数量级差异。通过EVOFLUx对侵袭性Richter转化型慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本进行系统发育分析，发现转化克隆的“种子”早在发病前数十年就已存在。临床观察显示，更具侵袭性的疾病亚型中肿瘤初始生长速度更快，进化史是强有力的独立预后因素。此外，通过整合额外遗传数据与临床变量，对EVOFLUx推断方法进行正交验证发现，这些广泛可用且成本低廉的批量DNA甲基化数据能够精准反映癌症演变动态。该成果以“Fluctuating DNA methylation tracks cancer evolution at clinical scale”为题已发表在Nature 上。

主要研究内容

EVOFLUx的工作原理是考虑样本中波动CpG甲基化值的异质性（图1a）。在二倍体基因位点，每个波动CpG可以处于三种状态之一：没有等位基因甲基化、一个等位基因甲基化或两个等位基因均甲基化。波动CpG的甲基化状态是独立变化的，这意味着它们可以作为“进化的条形码”来追踪克隆细胞的进化过程：亲缘关系密切的两个体细胞会具有几乎相同的波动CpG甲基化模式，亲缘关系较远的细胞则会有不同的波动CpG甲基化模式（图1b）。这意味着可以通过数学建模从输入的波动CpG数据中恢复样本的进化历史。

鉴于淋巴样肿瘤有着多种亚型，且临床生物学特征高度可变，肿瘤样本跨越了各疾病阶段。因此研究团队整合了来自正常淋巴细胞和淋巴肿瘤细胞的Illumina甲基化阵列数据，共计389,180个CpG位点。通过识别淋巴细胞特异性波动CpG位点，发现了978个泛淋巴细胞癌相关的波动CpG位点。波动CpG位点的甲基化模式在各种癌症中呈现出典型的“斑点状”分布，与传统的甲基化时钟或随机选取的CpG位点所呈现的有序模式形成鲜明对比。研究发现波动CpG显示出独立持续的等位基因特异性甲基化变化，独特地标记细胞系，并且倾向于位于基因组的沉默区域并且不受调控。

图1.波动CpG位点的筛选与特征分析。

基于上述结果，研究团队开发了EVOFLUx，通过模拟从患者出生到某一特定时间癌症相关克隆扩增开始的谱系中波动CpG甲基化的持续增益和损失，然后继续模拟不断增长的癌细胞群体中的甲基化波动，直到在时间T收集癌症样本（图2）。EVOFLUx包含了一种先进的贝叶斯推断方法，能够根据输入的波动CpG甲基化分布数据学习模型参数，同时考虑了肿瘤的纯度以及甲基化检测技术所带来的噪声。

图2.EVOFLUx模型可准确捕获波动CpG数据模式。

研究团队将EVOFLUx应用于1976例淋巴癌和癌前病变的样本中，包括急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）、急性B淋巴细胞白血病（T-ALL）、CLL、肥大细胞白血病（MCL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、多发性骨髓瘤、单克隆B细胞淋巴细胞增多症（MBL）等（图3）。结果显示，不同疾病类型的初始肿瘤生长速率、恶性程度和表观突变率存在数量级差异。其中，儿童ALL和成人淋巴样肿瘤表现出明显不同的进化历史。与其他淋巴细胞恶性肿瘤相比，ALL表现出更高的生长速率，更小的有效群体规模和更短的时间。T-ALL生长速度快于B-ALL，且生长速率更为均匀。在成人癌症中，MBL（CLL的前体）比CLL表现出较低的生长速度和较长的时间。此外，不同疾病的波动CpG转化率差异显著。儿科ALL的转化速度比成人恶性肿瘤快得多（图3c），且与生长率呈正相关，与患者年龄呈负相关。

图3.EVOFLUx揭示了淋巴癌的进化动力学。

同时，研究还分析了癌症的演变与分子亚型的关系。在MCL中，与更具侵袭性的传统MCL相比，通常更惰性的白血病非结性MCL具有更低的生长率（图3e）和Ne。在CLL中，根据IG基因重链可变区（IGHV）体细胞超突变的程度，可以定义两种主要的分子亚型：未突变CLL（U-CLL）和突变CLL（M-CLL）。更具侵袭性的U-CLL亚型比M-CLL表现出更高的生长率和更大的Ne，与肿瘤纯度无关。此外，TP53突变的M-CLL患者的生长率和有效群体规模更高（图3g）。

部分CLL患者会经历Richter转化，侵袭性更强，预后极为不良。研究团队利用EVOFLUx对侵袭性Richter转化型CLL样本进行了系统发育分析，发现最初的Richter转化早在诊断前就发生了，比转化克隆的临床表现早30多年。此外，在该队列中应用EVOLFUx，发现EVOFLUx在检测正在进行的亚克隆选择方面比基于WES数据的MOBSTER方法更有效。

最后，研究团队通过整合额外的遗传数据与临床变量，对EVOFLUx推断方法进行了正交验证。结果表明，这些广泛可用且成本低廉的批量DNA甲基化数据能够精准反映癌症演变动态。

图4.肿瘤演变是临床结果的预后因素。

结 语

癌症演变过程与其表型和临床结果密切相关。研究团队开发的高通量EVOFLUx方法仅使用广泛可用且低成本的批量甲基化数据作为输入，就可以在群体规模定量检测人类癌症演变过程，同时该方法还适用于基于测序的甲基化方法，以及从血液中的ctDNA。

全基因组DNA甲基化分析还可以检测癌症的其他重要生物学特征，研究团队将这些特征与基于EVOFLUx的演变推断相结合，可以进一步提高DNA甲基化数据的预后价值，为癌症生物学机制及临床行为提供了全新视角。

原文信息：

Gabbutt, C., Duran-Ferrer, M., Grant, H.E. et al. Fluctuating DNA methylation tracks cancer evolution at clinical scale. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09374-4