引言

随着现代医学技术的发展，肿瘤患者成为了医疗系统中增长最快速的人群之一。然而抗肿瘤治疗过程中引起心血管事件，是备受关注和最严重的并发症之一，并严重影响着肿瘤患者的预后。其中，以阿霉素(Doxorubicin, Dox)为例的蒽环类药物是目前最有效的化疗药之一，但因其在临床中引起心脏毒性而被限制使用。虽然临床上在抗肿瘤治疗中已提出多种手段保护心脏功能，但由于对Dox心脏毒性分子机制的认识有限，目前的防治措施仍是不足。

已有研究表明，线粒体损伤是Dox心脏毒性的主要原因。心肌细胞作为一类高度分化、高能量需求的细胞，其线粒体含量高，且再生能力远低于其他体细胞，提示了缓解心肌细胞的线粒体损伤很可能是解决Dox心脏毒性的关键靶点。

近年来，随着科学技术的发展，越来越多的微肽(sORF-encoded peptides, SEPs)被发现并且在生理病理过程中发挥着重要的调控作用。最新研究表明，绝大多数的SEPs定位于线粒体中，即线粒体微肽(mitochondrial sORF-encoded peptides, mSEPs)，调控线粒体功能，参与到细胞代谢和应激反应等生命活动中。因此，从线粒体微肽为切入点，鉴定出Dox心脏毒性的关键靶点，具有重要的临床意义。

中山大学附属第一医院黄展鹏研究员课题组基于以上科学问题，在Dox体内外损伤模型中展开了系统性的筛选工作，鉴定出心肌细胞富集的保护性线粒体微肽，并将其命名MODICA (Mito-SEP protector against DOX-induced cardiac injury)，进一步深入探讨了MODICA缓解Dox心脏毒性的作用机制。相关工作近期以题为“Mitochondrial sORF-encoded peptide MODICA protects the heart from doxorubicin-induced cardiac injury by suppressing VDAC oligomerization”的研究论文在线发表于中科院一区心血管杂志Circulation：Heart Failure中。 

结果

1. 系统性筛选发现MODICA在Dox心脏损伤中起保护作用

14个来自最新人类基因组线粒体微肽数据集的mSEPs，结合人类心脏单细胞数据库和分子生物学的相关分析显示，5个mSEPs是心肌细胞富集的线粒体微肽。 

通过腺病毒介导的心肌细胞过表达系统，以及由心肌细胞特异性启动子cTNNT2介导的AAV9腺相关病毒实现心脏特异性过表达系统，构建了体内外的mSEPs过表达体系。进一步的功能筛选发现，mSEP-4和mSEP-5在Dox体内外损伤模型中显示出保护作用。由于mSEP-5在心肌细胞中的富集程度远高于mSEP-4而被进一步研究，并命名为MODICA (Mito-SEP protector against DOX-induced cardiac injury)。 

2. MODICA是定位于线粒体外膜的保守微肽

氨基酸序列保守性分析、蛋白酶K保护实验结合siRNA敲降实验显示，MODICA是定位于线粒体外膜的保守微肽，并且进一步的心肌和非心肌细胞分析显示，MODICA显著富集于心肌细胞中，这一结论与上述是一致的。 

3. MODICA在Dox心脏损伤中下调表达

接下来，研究者进一步探讨MODICA在Dox损伤模型中的变化情况。结果显示，无论是在体内还是体外损伤模型中，MODICA的RNA和蛋白水平均显著下降。这一结论在来自GEO数据库中，iPSCs和ESCs的Dox损伤模型中得到进一步验证。 

4. MODICA过表达缓解Dox引起的心肌细胞凋亡

为了进一步确认MODICA在心肌细胞的保护作用，来自乳大鼠心肌细胞bulk RNA-seq的富集分析结果显示，异常的信号通路有64个，其中上调数量为24，下调为40。进一步的KEGG富集分析结果显示，“release of apoptotic factors from the mitochondria pathways”这一通路显著下调。 

同时多项凋亡指标(TUNEL、Annexin V以及BAX/Bcl2比例)的结果均显示MODICA抑制了Dox引起心肌细胞的凋亡水平，从而缓解了Dox引起心肌细胞的活性下降。 

5. 心脏特异性过表达MODICA缓解Dox引起小鼠心脏功能障碍

同样的，对MODICA在缓解小鼠Dox心脏毒性的保护作用进一步验证。通过由cTNNT2启动子介导的AAV9病毒，实现了小鼠心脏特异性过表达MODICA，且与内源性的MODICA等比例过表达。此外，考虑到Dox在乳腺癌患者中应用广泛，小鼠性别是不可忽略的因素，因此动物实验在雄性和雌性小鼠中进行了验证。结合Dox心脏损伤处理，结果显示MODICA过表达可缓解雄性和雌性小鼠在Dox引起的体重以及心脏重量下降。 

进一步心脏超声结果显示，MODICA的过表达显著缓解了小鼠心脏功能障碍、心脏纤维化水平、心肌细胞萎缩。与体外实验结果一致的是，过表达MODICA缓解Dox引起小鼠心脏细胞凋亡。 

6. MODICA的缺失加剧了Dox引起的小鼠心脏功能障碍

为了进一步探讨MODICA在Dox小鼠心脏损伤模型中的作用，研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MODICA全身缺失小鼠。Sanger测序和Western-blot结果显示，MODICA-Het小鼠中的MODICA蛋白水平显著下降。 

接下来，研究者在以上小鼠中建立Dox慢性心脏损伤模型，心脏超声结果显示，与同窝的WT小鼠相比，MODICA-Het小鼠的心脏功能显著恶化，同时伴随着心脏纤维化水平和凋亡水平的升高。 

7. MODICA与凋亡相关分子VDACs结合

为进一步探索MODICA在调节Dox诱导的心脏损伤中的作用机制，研究者利用IP结合质谱分析鉴定出MODICA潜在的相互作用分子。候选蛋白的GO富集分析结果显示，与MODICA在线粒体的定位一致，研究者观察到细胞成分中线粒体蛋白显著富集。此外，与MODICA的抗凋亡功能一致，研究者还观察到与凋亡过程负调控相关的信号通路蛋白也被富集到。进一步的Cytoscape分析结果显示，Vdac3在核心作用基因网络中是唯一的线粒体外膜蛋白。接下来利用CO-IP和体内pull down实验进一步证明，MODICA与VDAC1、VDAC2和VDAC3蛋白相互结合。 

8. MODICA抑制VDACs的多聚化，缓解Dox引起心肌细胞的线粒体损伤及收缩功能障碍

先前的研究表明，VDAC多聚化与凋亡密切相关。在线粒体压力下，VDACs会多聚化在线粒体外膜上形成更大的孔径的通道，导致细胞色素c、线粒体DNA片段等的释放，从而促进凋亡发生。那么，MODICA与VDACs结合，是否抑制了VDACs的多聚化呢？通过western-blot结果可见，Dox处理显著诱导了NRVCs中VDAC1多聚体的水平，而MODICA过表达显著减少了这个现象，表明MODICA降低了Dox引起的VDAC1多聚体的形成。 

那么MODICA具体如何影响了线粒体功能呢？研究者进行了seahorse线粒体压力分析实验，结果显示，Dox处理会引起NRVCs的最大呼吸速率以及呼吸储备容量的下降，而MODICA过表达缓解了这些现象，这些结果表明MODICA可以缓解Dox引起的线粒体功能障碍，促进线粒体的氧化磷酸化水平。 

以往研究表明，钙信号的动力学变化与细胞机械收缩之间存在直接对应关系，验证了钙瞬变是心肌细胞收缩功能的可靠指标。研究者进行了NRVCs的钙瞬变实验来评估MODICA对心肌细胞收缩功能的影响，根据结果可见，Dox的处理使得NRVCs钙信号增幅的下降、信号上升到峰值以及信号回落的时间延长，意味着Dox处理使NRVCs的钙信号处理能力失调，而这些现象在MODICA过表达组均可以得到缓解。因此，MODICA可以缓解Dox引起NRVCs的钙信号处理能力失调，进而改善其收缩功能。

结论

该研究通过系统筛选鉴定出MODICA是一种定位于线粒体外膜的保守微肽，并在抵抗阿霉素(Dox)诱导的心脏损伤中发挥关键调控作用。体内外的结果显示，Dox处理可下调心肌细胞中MODICA的表达，而心脏特异性过表达MODICA可保护Dox处理小鼠的心脏功能并减轻心脏纤维化，相反，MODICA的缺失则加重了心脏功能障碍。机制研究显示，MODICA与凋亡相关分子VDACs蛋白相互作用，抑制Dox诱导的VDACs在线粒体外膜上的多聚化，从而维持线粒体完整性并减少心肌细胞凋亡。综上，MODICA作为一种新的线粒体应激反应微肽，可能成为缓解Dox心脏毒性的潜在治疗靶点。

该研究获得中山大学附属第一医院的区景松教授、董吁钢教授、廖新学教授、陈艺莉教授和刘晨教授的指导和帮助。

黄展鹏研究员课题组的主要研究方向为心肌重构及心力衰竭中的基因调控网络，着重研究其中的翻译调控机制和由lncRNA上sORF编码翻译的微肽分子，并以探寻新的心肌肥厚及心力衰竭临床治疗干预靶标为目标。课题组的研究获国家重点研发计划项目(2021YFA1302500)、国家自然科学基金委联合基金重点项目(U23A20396)、面上项目(82270252; 81873463)、广东省自然科学基金杰出青年项目(2019B151502003)等项目经费的支持。课题组近年来的在Nat Cardiovasc Res、 JCI、Cardiovasc Res、Mol Ther、STTT等中科院一区期刊发表多篇相关论著，有意加入团队的小伙伴请联系: [email protected]。

原文链接：

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCHEARTFAILURE.125.013381