商业化嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是从患者自身来源的白细胞分离术（leukapheresis，简称单采）起始材料中制造的。单采起始材料的质量和特性已被确定为自体CAR-T细胞产品制造失败的潜在根本原因。自体CAR-T生产失败不仅影响治疗，还给患者、医疗服务提供者和CAR-T制造商带来了诸多障碍。

《Molecular Therapy》近日发表综述，描述了可能影响自体单采起始材料质量的因素，对患者相关因素进行了特征描述，例如单采前的肿瘤治疗和洗脱期、疾病状态以及临床/实验室结果及其对单采细胞组成的潜在影响。还讨论了与单采程序相关的因素，包括细胞采集程序、当前最佳实践和指南、护士经验以及面临的挑战。后续讨论了在制造前的冷冻保存，包括时间、冷冻保护剂、浓度、冷却速率和细胞稳定性。最后，针对上述每个论点，提出了知识空白和未来研究方向。通过全面的文献评估，可以支持关于流程优化、减少制造失败以及长期协调实践的讨论。

引言

CAR-T疗法通过利用工程T细胞的特异性和适应性，彻底改变了血液恶性肿瘤的治疗格局。然而，要实现CAR-T疗法的最佳效果，需要应对患者特异性因素、程序复杂性以及制造挑战之间的复杂相互作用。从患者资格评估、单采到制造、冷冻保存以及最终CAR-T产品交付的整个过程，存在许多影响疗效和安全性的变量。

在现行良好生产规范（cGMP）下，自体CAR-T细胞的制造通常是一致的，即使制造协议设计存在差异，包括解冻冷冻的单采材料（或使用新鲜材料），然后进行T细胞分选（或不分选）、激活、遗传修饰、扩增和制剂。

尽管在GMP环境中使用标准化的制造协议，但CAR-T细胞制造的主要变异性来源包括：操作变异性（SOP、人员、设备）、原材料和试剂（临床级）、环境变异性（颗粒计数、温度、压力差）以及生物因素（起始材料）。在严格控制大多数关键参数的情况下，患者起始材料的变异性对CAR-T制造过程的影响最大。此外，一小部分（但不可忽视患者）由于制造失败或未收到符合放行规范的产品而无法接受CAR-T细胞产品，这主要归因于起始材料的质量，T细胞的功能状态（而非绝对T细胞计数）是制造失败的原因。

该综述汇编了影响CAR-T起始材料质量的关键因素，重点介绍了患者准备、单采和冷冻保存及其对T细胞功能的影响（图1）。

在本综述的范围内，高质量的自体单采起始材料客观定义为：收集的起始材料具有足够的细胞数量和令人满意的细胞功能状态，能够成功制造CAR-T产品，按照严格的无菌技术收获，符合可追溯性要求，根据验证的过程进行冷冻保存（如果不是用作新鲜材料），并符合赞助公司的机构备案的质量规范。通过探索最新证据和识别关键差距，本综述旨在突出可操作的策略和研究重点，以优化CAR-T制造和临床应用。随着CAR-T疗法的不断发展，解决这些挑战对于推进精准医疗、提高可扩展性和扩大全球患者获得治疗的机会至关重要。

单采前的患者特征

自体CAR-T疗法依赖于收集患者自身的T细胞作为起始材料。因此，包括既往病史、疾病状态、既往治疗和免疫档案在内的个体患者特征深刻都会影响收获的单采材料的质量，进而影响制造过程。理解这些因素之间的相互作用对于优化CAR-T结果和推进精准医疗的原则至关重要，可以实现患者分层、预测生物标志物的开发，以及为特定患者群体量身定制新型CAR-T产品的工程设计。

临床证据强调，疾病负担、年龄、既往治疗和免疫环境等因素都会损害T细胞功能，从而降低制造成功率并限制疗效。具有免疫抑制或淋巴毒性的药物，包括皮质类固醇、免疫调节剂（IMiDs）和烷基化剂，对单采材料的质量尤其有害。本部分总结了当前关于患者特定因素的证据，强调了风险缓解策略，并确定了需要进一步研究的领域。

患者表现和临床病史

基于患者病史的单采前算法可用于预测单采材料的质量。例如，Tuazon等人确定了关键因素，如年龄、疾病类型和白细胞分离术前血小板计数与B细胞恶性肿瘤患者的淋巴细胞回收率（CE）降低（<40%）相关。高龄（每增加10岁的比值比 [OR] = 1.51；p = 0.034）和更高的单采前血小板计数（每增加10 x 10³/μL的OR = 1.07；p = 0.005）是低CE的显著预测因子，可能是由于单采期间血小板聚集和单核细胞（MNC）界面变窄。尽管CE较低，但在大多数情况下仍可获得足够的T细胞用于制造。这些发现强调了优化单采设置的必要性，特别是在老年患者中。

同样，Jo等人表明，血清乳酸脱氢酶（LDH，肿瘤负担和髓系炎症的标志物）水平升高与弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的制造失败相关。这些发现表明，疾病进展的标志物可以作为制造成功的重要预测因子。

单采前治疗及其对T细胞的影响

烷化剂和干细胞移植的影响

暴露于苯达莫司汀和达剂量马法兰（HDM）等烷化剂与循环系统和收集的单采材料中T细胞表型不良相关，具体表现为CD8+效应记忆T细胞（TEM）比例增加、CD8+终末分化效应记忆细胞（TEMRA）减少以及CD4:CD8比值降低。这些变化表明T细胞耗竭和增殖能力下降，可能影响CAR-T细胞制造成功率。Iacoboni等人进一步发现，在HDM及自体干细胞移植后三个月内进行单采会导致T细胞扩增率显著降低。因此，在HDM及自体干细胞移植后至少延迟三个月进行单采成为恢复T细胞功能的关键建议。

在讨论既往治疗时，需要区分单采前用于控制疾病的治疗（称为“holding治疗”）与在CAR-T细胞制造期间使用的治疗（称为“桥接治疗”）。holding治疗旨在通过不影响T细胞数量和功能（避免对CAR-T制造成功率造成负面影响）的治疗来控制疾病；而桥接治疗则旨在减轻疾病负荷并避免临床恶化。因此，烷化剂（如苯达莫司汀）和T细胞衔接剂（后文也将讨论）可推荐用于桥接治疗，但在holding治疗期间避免使用。

皮质类固醇和免疫调节剂的影响

常用于血液恶性肿瘤管理的皮质类固醇可对T细胞活性和激活产生不良影响。来那度胺等免疫调节剂（IMiDs）以及达雷妥尤单抗等单克隆抗体会加剧T细胞耗竭，降低CAR-T疗法收集材料的质量。

在单采前给予伊布替尼等新兴策略显示出逆转T细胞耗竭的希望，从而增强CAR-T细胞扩增率和功能。

双特异性抗体治疗对单采的影响

随着双特异性T细胞结合抗体（BsAbs）在血液恶性肿瘤治疗中的应用增加，人们对其对单采材料质量和CAR-T细胞制造的潜在影响表示关注。BsAbs通过CD3、CD20或BCMA等抗原介导持续的T细胞激活，可能改变收集产品的细胞组成，从而影响下游过程和疗效。

Vucinic等人的回顾性研究发现，先前暴露于BsAbs与CAR-T制造期间的偏差事件（OOS）发生率增加相关，主要原因是T细胞增殖和扩不足。同样，Fandrei等人观察到，在单采前接受BsAbs治疗的患者表现出T细胞克隆性增加，可能影响输注后CAR-T细胞的持久性。尽管存在这些潜在问题，也有研究表明，BsAbs暴露不一定影响CAR-T的疗效。Iacoboni等人的大型回顾性分析强调了考虑末次BsAbs给药与单采之间洗脱期的重要性，因为持续的T细胞激活可能影响单采的产量和制造成功率。

这些发现突出了将BsAbs整合到涉及CAR-T疗法的治疗序列中的复杂性。虽然BsAbs可作为有效的桥接治疗，但优化单采与BsAbs暴露的时机至关重要，以确保CAR-T细胞制造的最佳起始材料。最近，国际骨髓瘤工作组（IMWG）免疫疗法委员会根据“现有证据”发布了关于双特异性T细胞结合抗体和CAR-T细胞的最佳序贯治疗以及单采前洗脱期的建议（详见Costa, L.J., Banerjee, R., Mian, H., Weisel, K., Bal, S., Derman, B.A., Htut, M.M.,  Nagarajan, C., Rodriguez, C., Richter, J., Frigault, M.J., et al. (2025). International myeloma working group immunotherapy committee recommendation on sequencing immunotherapy for treatment of multiple myeloma. Leukemia 39, 543-554. 10.1038/s41375-024-02482-6.）。需要进一步研究，以确定最佳洗脱期，并评估单采前的干预措施（如细胞因子调节或T细胞选择策略）是否可以缓解潜在的制造挑战。

疾病负担和肿瘤微环境

晚期血液恶性肿瘤以显著的免疫失调为特征。高肿瘤负担会加剧T细胞耗竭和抑制性信号传导，其中调节性T细胞（Tregs）和髓系来源的抑制细胞（MDSCs）会降低CAR-T细胞的疗效。单采产品中的污染细胞（如循环白血病细胞或抑制性细胞）会进一步损害制造过程，导致转导效率降低和CAR-T细胞活性减弱，在极少数情况下，还可能导致白血病细胞的CAR转导。在输注tisa-cel和axi-cel后不久循环中的CAR-Tregs增加，而在从冷冻单采材料开始制造的CAR-T细胞产品中则较少出现这种情况，提示Tregs对冷冻保存的敏感性可能是该现象的原因。

Holding治疗可以帮助在单采前减少肿瘤负担，但可能会意外地导致T细胞耗竭。在制造前进行针对性干预，例如选择性地清除Tregs或MDSCs（后者通过T细胞选择实现），已显示出在减轻肿瘤微环境影响方面的希望。

系统炎症和外周血特征

系统炎症通常表现为IL-6和TNF-α水平升高，与CAR-T制造过程中T细胞扩增率降低相关。据报道，在单采当天，在无持久反应的患者中，外周血中的铁蛋白、IL-6、LDH、CRP和髓系细胞激活水平呈现升高。

主动使用抗炎剂（如托珠单抗）可以在保持制造时间表的同时恢复T细胞扩增。对CMV和EBV等感染的筛查至关重要，因为潜伏感染的再活化会加剧系统性炎症并降低CAR-T细胞的活性。

多个研究组调查了单采当天循环中的生物标志物，这些标志物可预测对CAR-T疗法的反应。单核细胞与白细胞比值（AMC/ALC）高和B细胞频率低，可识别出在CAR-T输注后进展风险高的淋巴瘤患者。CD14+单核细胞频率高会增加CAR-T制造失败的风险，因此单采材料清除单核细胞的策略或许可行。

年龄和免疫衰老

衰老与免疫衰老相关，会减少初始T细胞的可用性，并增加衰老和耗竭的记忆T细胞。Lin等人发现衰老与T细胞受体多样性降低直接相关，强调了老年患者中干细胞记忆T细胞（TSCM）亚群的耗竭。通过使用细胞因子混合物（如IL-7和IL-15）进行体外富集的缓解策略已显示出选择性扩增初始T细胞的能力，并改善输注后的CAR-T细胞持久性。

总结

深入理解患者特定特征和单采前条件对于优化CAR-T疗法的制造和结果至关重要。未来的研究应关注完善患者分层工具、开发预测生物标志物以及实施定制干预措施以改善T细胞质量。这种方法将有助于推进CAR-T疗法领域的精准医疗。

影响CAR-T疗法结果的其他患者特定因素

除了年龄、疾病负担和既往治疗等主要考虑因素外，其他患者特定因素（如遗传倾向、共病、免疫检查点表达和早期干预策略）也显著影响单采材料的质量和CAR-T疗法的成功率。理解和应对这些因素对于优化制造结果和提高患者对CAR-T疗法的反应至关重要。

遗传和表观遗传影响

患者的遗传和表观遗传特征在决定免疫细胞功能和CAR-T疗效方面发挥着越来越重要的作用。例如，免疫调节基因（如TP53）的遗传改变在血液恶性肿瘤中经常被观察到，这些改变会损害免疫监视和CAR-T细胞的持久性。此外，由于单采前治疗导致的T细胞中的表观遗传改变（如异常的DNA甲基化或组蛋白修饰）可能会破坏T细胞激活和扩增的关键转录程序。

一种缓解策略是使用表观遗传修饰剂，如组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，这些药物可能有效地重新编程T细胞，增强其在制造过程中的扩增，并增强其抗肿瘤活性。在单采前识别具有不利遗传或表观遗传特征的患者，可以指导个性化的预处理方案，旨在改善T细胞功能。

共病和免疫功能

符合条件接受CAR-T疗法的患者通常存在共病，如糖尿病、心血管疾病或慢性感染，这些共病会加剧系统性炎症并损害T细胞质量。例如，糖尿病与IL-6等炎症细胞因子水平升高相关，这会加剧免疫耗竭。同样，涉及慢性低度炎症的心血管疾病会降低T细胞活性并改变免疫细胞亚群。

共病显著影响单采材料的质量。外周血中髓系来源的抑制细胞（MDSCs）或衰老淋巴细胞水平升高的异常血液特征会对CAR-T制造结果产生负面影响。在单采前优化共病（如糖尿病患者的血糖控制）可能会改善收获的T细胞质量。

T细胞中的免疫检查点表达

在晚期血液恶性肿瘤患者的T细胞中，免疫检查点分子（如PD-1、LAG-3、TIM-3和TIGIT）经常被上调。这些分子的高表达与T细胞耗竭相关，影响CAR-T细胞制造、降低增殖能力和减少CAR-T疗效。

在单采前使用免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体）进行调节，可能会恢复耗竭T细胞的功能，改善其在制造过程中的扩增。然而，平衡检查点抑制的效果至关重要，因为过度激活会增加CAR-T疗法期间的毒性风险。这些发现强调了根据患者特定的免疫特征量身定制检查点阻断策略的重要性。

早期干预和抢先（Pre-Emptive）单采

与CAR-T输注淋巴瘤患者中的完全和持久反应相关，单采当天循环中的抗原经验型CD45RO-CD27+CD8+ T细胞表现出长寿记忆细胞的特性。此外，具有初始/TSCM细胞表型的T细胞在CAR-T制造期间展现出更好的细胞功能和更短的群体倍增时间，并在输注后带来更好的结果。富含未分化T细胞的单采材料产生的CAR-T细胞效果更好，在早期治疗线患者中尤为明显。另一方面，据报道，较短的制造时间可以产生在输注后保持T细胞干性的CAR-T细胞产品。

因此，抢先单采是一种新兴策略，旨在在先进治疗损害免疫细胞质量之前收集T细胞。这种方法对于预后不良因素的患者特别有益，如难治性疾病或快速进展，后续治疗可能诱导T细胞耗竭或衰老。

有证据表明，抢先单采获得的T细胞具有更高的增殖潜力和更少的耗竭标志物，如TIM-3和PD-1。例如，从多发性骨髓瘤患者在强化疗前收集的T细胞显示出优越的CAR-T扩增率和细胞因子产生能力。物流障碍、保险覆盖和最佳时机等挑战仍然是广泛实施的重要障碍。需要进一步研究以建立抢先单采的标准化方案。

新兴证据强调了应对患者特定因素（如遗传倾向、共病和免疫检查点表达）在优化CAR-T治疗结果中的重要性。需要进一步研究以更好地理解表观遗传修饰对T细胞功能的影响，并开发逆转这些变化的干预措施。特别需要进行比较研究，以评估不同holding治疗策略对T细胞表型的影响。整合患者特定变量的标准化方案可以显著增强CAR-T细胞制造结果和临床疗效，并促进个性化治疗。最重要的是，需要建立一个具有客观生物学参数的细胞含量/细胞标志物档案，以表征具有高制造成功率的最优单采材料。

单采：收集单个核细胞（MNC）最安全且耐受性最佳的方法

单采是收集单个核细胞最安全且耐受性最佳的方法。本节将讨论与单采收集程序相关的因素，这些因素可能影响起始材料的质量。在本节的范围内，保持高质量的起始材料涉及：收集足够数量的细胞、患者对程序的耐受性、符合不同CAR-T制造商的收集要求以及完全可追溯性。

耐受性和采集目标

通过单采采集单个核细胞（MNC）是安全、耐受性好且高效的方法，但用于T细胞制造的最优单采参数尚未实现标准化。从动员后的全血中收集造血祖细胞（CD34+）所获得的经验虽然提供了宝贵的见解，但无法直接应用于T细胞收集，因为非动员患者的T细胞特性与CD34+细胞存在显著差异。具体而言，在T细胞收集过程中，特别是在白细胞计数低或目标为成熟T细胞（比CD34+细胞更小、更密集）的患者中，离心过程中建立红细胞与白细胞界面更具挑战性。

单采前评估

单采前进行完整的血细胞计数（CBC）至关重要，以确认骨髓再生并确保程序期间患者的安全。通常，纳入标准包括血红蛋白（Hb）≥8.0 g/dL、血小板（PLT）计数≥20×10⁹/L、绝对淋巴细胞计数（ALC）≥0.2×10⁹/L，以及生命体征稳定。需排除活动性感染。对于可能会因单采出现不良临床影响的患者（如有体温不稳定或钙钾水平波动的患者），必须识别并密切监测。

有研究组利用单采前的实验室数值（结合或不结合临床变量）开发了预测模型和策略，以优化收集过程。这些策略会相应地调整处理的总血量或输注方案。

单采护士的作用

由于在静脉通路管理、技术监督、电解质和血流动力学平衡、患者沟通以及实验室数值监测方面具有专业知识，经验丰富的单采护士在CAR-T收集过程中发挥着关键作用。他们必须在收集过程中解决界面变化的问题，以确保高质量的起始材料。相关任务包括监控泵速、评估在线材料的颜色和组成、调整抗凝剂（ACD-A）输注速率以及优化收集体积并管理程序中的不良事件。

行政责任包括确保准确标记、完成文件记录以及维护可追溯性，以保障身份连贯性。严格遵守CAR-T制造商手册和内部SOP对于确保一致性和减少错误至关重要。

静脉通路

确定适当的静脉通路对于保持一致的血流和界面稳定性至关重要。一般首选外周通路，但对于静脉较小、弹性较差的患者可能不够用。如有必要，可使用大口径、高流量、双腔中心静脉导管（CVC），以便实现更高的流入速率和更大的处理血量。CVC对于单个核细胞或T细胞计数低的患者特别有益，但会增加细菌污染的风险，可通过严格的无菌技术来降低该风险。

单采程序

设备及细胞收集程序

可使用多种系统收集白细胞分离材料，最常用的是Amicus（Fresenius Kabi，德国）和Spectra Optia® MNC或cMNC（Terumo BCT，美国）。系统选择受日程安排、患者因素（如血容量、临床状况、目标细胞计数）及设备可用性影响，进而影响单采材料质量。

比较不同收集系统的研究突出了显著差异。例如，Punzel等人报告称，Spectra Optia的MNC程序较cMNC程序需处理更多血液，耗时更长，但两者细胞产量相似；Pineyroa等人表明，Amicus系统在处理1个全血容量时，能充分收集淋巴细胞，同时最小化血小板丢失并改善患者舒适度。

最佳实践和指南

多个专业学会和联盟提出了全球统一白细胞分离实践的建议，例如细胞治疗认证基金会（FACT）、欧洲血液与骨髓移植学会（EBMT）、国际细胞治疗学会与EBMT联合认证委员会（JACIE）等组织提供了管理CAR-T起始材料及供应链的指南，重点是维持产品质量并确保患者及医护人员安全。

移动白细胞分离服务

移动白细胞分离服务为偏远地区或收治能力有限的机构的患者提供了解决方案。这些服务提供培训有素的员工、合规监管及监控设备，有助于扩大细胞治疗的可及性。然而，移动服务也带来了维持质量监督和确保员工培训充分性的挑战。

差距与未来方向

预测工具：许多预测模型基于单中心数据，需通过更广泛的研究验证。改进算法可通过根据个体患者特征程序，同时减少程序时间，优化白细胞分离效率。

静脉通路：中心静脉通路与外周静脉通路的选择仍有争议。外周通路降低感染风险，但血流速率不稳可能影响产品质量，亟需进一步研究明确最佳实践。

数据共享：CAR-T制造商的数据共享有限，阻碍了收集中心完善和标准化程序的能力。GoCART联盟等协作计划旨在通过在各利益相关者间建立协调实践来解决这一缺口。

单采是CAR-T制造的关键步骤，其成功取决于优化收集实践、降低风险和解决患者特定因素。未来应致力于验证预测模型、通过移动服务改善可及性及标准化程序，以提升CAR-T疗法质量和可扩展性。

CAR-T的冻存

冷冻保存在CAR-T细胞制造中起着关键作用，它使生产过程具有物流灵活性和可扩展性。通过使用封闭系统进行冷冻保存，可以提供额外的安全性和无菌性。本节讨论这些因素的当前证据，并评估其对冻存白细胞分离材料的CAR-T细胞制造的影响。

冷冻保存的范围界定：本节专门讨论单采前的冷冻保存，不涉及制造后最终CAR-T细胞产物的冻存或长期储存，这是一个不同的过程。在目前已批准的CAR-T疗法中，tisagenlecleucel（tisa-cel）和ciltacabtagene autoleucel（ciltacel）使用冻存的单采材料进行制造；其他批准的产品通常依赖于新鲜单采收集物。在床旁（point-of-care）CAR-T生产模型中，由于收集和输注与制造设施距离接近，可能不需要冻存。

时间和温度

单采后进行冻存的时间对细胞复苏和功能有显著影响。Fernandez-Sojo等人发现，单采到冻存的运输时间超过36小时会导致解冻后CD34+和CD3+细胞的活性显著降低。同样，Angel等人观察到，在模拟运输条件下，延迟会导致凋亡增加和T细胞反应性降低。

这些研究强调了尽量减少冻存前时间的重要性，特别是为了维持T细胞活性。然而，用于评估冻存长期影响的多中心数据集很少，特别是比较新鲜和冷冻保存产品的数据集，且关于不同患者群体和分散制造中心的数据有限。未来的研究应调查预先调节干预措施，如稳定溶液或运输期间的控制温度，以缓解不可避免的延迟导致的活性损失。

冷冻保护剂配方

二甲基亚砜（DMSO）是CAR-T制造中常用的冷冻保护剂，因其在防止冰晶形成方面的有效性。然而，DMSO由于在长时间暴露时的细胞毒性而带来挑战。Pi等人探索了基于糖和氨基酸的替代方案，这些方案在减少渗透压应激的同时保持细胞活性方面显示出希望。Kaiser等人发现，将DMSO浓度降低至5%可以提高调节性T细胞的复苏率，而标准浓度为10%。

尽管DMSO的替代方案显示出希望，但与标准方案的直接比较有限。此外，针对特定T细胞亚群（如辅助T细胞与细胞毒性T细胞）敏感性的冷冻保护剂的研究还不足。新证据表明，单采材料的冻存可能会改变最终CAR-T产品的细胞组成，包括增加调节性T细胞（Tregs）的频率，可能对体内CAR-T细胞的增殖和效应功能产生负面影响。

开发冷冻保护剂的标准化评估标准可以加速其在CAR-T工作流程中的应用，并增强制造结果。

冷却和解冻速率

冷冻-解冻循环对细胞完整性构成显著风险。Baboo等研究表明，较慢的冷却速率（-1°C/分钟）可以减少冰的重结晶，从而保护细胞免受机械损伤。而较快的冷却速率（-10°C/分钟）结合缓慢的解冻速率（-1.6°C/分钟至-6.2°C/分钟）由于结构破坏导致细胞损失增加。在45°C至113°C的温度范围内快速解冻可减轻损伤，防止二次冻结损伤。

冷冻-解冻过程是决定CAR-T细胞活性的关键因素。使用优化的冷却曲线的受控速率冷冻（CRF）可以精确调节冷却速率，从而最小化细胞内损伤。研究表明，CRF减少冰晶形成，增强解冻后的细胞复苏率。此外，快速受控的解冻温度（45-50°C）可以防止二次冰晶重结晶，提高解冻后细胞的整体功能。进一步的证据表明，冻存影响CAR-T细胞的活性和扩增潜力，解冻后的复苏显著受冷冻前条件和解冻方案的影响。热管理算法的进步进一步完善了这些过程，确保细胞批次的均匀冷冻和解冻，减少变异性，提高CAR-T制造的重现性。

继续在可扩展和自动化的冻存系统中进行创新，并结合严格的验证研究，对于可重现、高质量的CAR-T制造至关重要。

长期储存

在集中制造模式中，冻存的单采材料的长期储存是必不可少的。Angel等指出，短暂升温事件超过-60°C是导致冰重结晶和细胞损伤的关键阈值。通常来说，低于-130°C的长期储存是有效的，然而，在运输或储存期间的温度波动可能会损害细胞质量。

先进的冷冻运输箱（如SMART运输箱）现在可以提供运输过程中对温度、湿度和冲击的实时监测，确保精确的环境控制。这些运输箱使用集成传感器提供连续反馈，最小化温度偏差的风险。此外，Chamberlain等强调，运输验证协议对于确保在不同的运输条件下细胞活性至关重要。使用卫星通信网络的自动跟踪等创新进一步增强了安全性和可靠性。

现存问题和未来方向

尽管取得了显著进展，但仍存在一些关键问题：

• l   单采时机优化：关于如何通过预先调节策略来抵消冻存延迟影响的数据有限。

• l   冷冻保护剂研究：目前缺乏将新型冷冻保护剂与基于DMSO的配方进行直接比较的研究。

• l   方案不一致：不同研究和工作流程中冷却和解冻速率的差异带来了重现性挑战。需要标准化方案以减少细胞复苏率、活性和表型方面的差异。Wei等人表明，即使是转移温度和设备（例如液氮与传导冷却器）的微小变化也会影响一些供体的扩增潜力。

• l   缺乏大型数据集：用于评估冻存长期影响的多中心数据集很少，特别是比较新鲜和冷冻保存产品的数据集。Brezinger-Dayan等人发现起始材料状态（新鲜与冷冻保存）与反应率之间没有相关性，但全面的免疫表型分析有限。

• l   对最终产品组成的影响：需要更多研究来明确单采冻存如何影响Tregs富集及随后的CAR-T细胞表现。

• l   T细胞亚群生物标志物：目前对于单采时哪些T细胞亚群表型能够预测成功的CAR-T制造或临床反应尚无共识。这限制了制造结果，使其受收集时患者循环免疫档案的变异性影响。确定可靠的生物标志物可以帮助确定最佳的单采时机，以最大化产品质量。

• l   冷冻保护剂的作用机制理解：尽管DMSO仍是标准冷冻保护剂，但其在制造过程中对T细胞激活、分化和细胞因子产生的精确影响尚未完全明确。一些研究表明解冻后可能存在功能障碍（例如细胞因子分泌减少），但活性得以保留。

未来研究应优先开展多中心试验以填补这些空白，重点关注协调方案、自动化冻存流程和整合先进监测技术。在标准化条件下比较新鲜和冻存的CAR-T产品的研究将为优化制造和临床应用提供关键见解。

单采产品的冻存是CAR-T疗法的一个重要组成部分，实现了生产的物流灵活性和可扩展性。然而，冻存对细胞活性、表型和功能的影响表明需要进一步研究以完善方案并解决变异性问题。通过标准化实践、开展大型研究和探索创新技术，该领域可以实现一致的结果，最终规模化改善CAR-T细胞疗法。

总结

CAR-T疗法在治疗血液恶性肿瘤方面取得了变革性进展，但其成功依赖于克服患者准备、单采、冻存和制造过程中的复杂挑战。本综述汇总了最新证据，强调了患者特定因素、程序变量和冻存实践如何影响治疗效果和可扩展性。通过确定冻存方案的变异性、单采的标准化指南缺乏以及新鲜和冻存产品之间大型比较数据的不足等关键空白，本综述为优化CAR-T制造和临床应用提供了框架。

解决这些挑战需要学术界、工业界和临床实践的共同努力。标准化方案、多中心试验和冻存技术的创新对于减少变异性和确保大规模可重复性至关重要。此外，早期干预措施（如抢先单采和个性化冻存策略）为改善预后不良因素患者的T细胞质量提供了有前景的途径。

最终，弥合这些差距将使CAR-T疗法能够充分发挥其作为可扩展、可及且高效的治疗手段的潜力。随着精准医疗的持续进步，该领域有望扩大其对更广泛的恶性肿瘤和患者群体的影响，为需要挽救生命的疗法的人们带来希望。

参考文献

Blanco BV, Mfarrej B, Lu H“J”, Irwin L, Salmon J, Morris D, Bowden R, Advancing CAR-T Cell Therapy: Insights into Patient Biology, Leukapheresis, and Cryopreservation, Molecular Therapy (2025), doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.07.045